水稻T-DNA 插入突變點兩側序列解序方法之比較及插入點之研究

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Title:	水稻T-DNA 插入突變點兩側序列解序方法之比較及插入點之研究 The study of flanking sequences generate methods and the insertion sites of rice T-DNA mutant lines
Authors:	鄭堯中
Contributors:	保健營養生技學系碩士班
Date:	2007
Issue Date:	2009-10-09 07:42:52 (UTC+0)
Publisher:	亞洲大學
Abstract:	目前從事水稻功能性基因之研究主要以 T-DNA 作為 Tag 以利進一步研究，對於逆向遺傳學的研究來說，獲得 T-DNA 插入突變點之(Flanking sequence tag, FST) 是不可或缺的，我們可藉由所獲得的 FST基因型，與植株表現型相比對，進而研究瞭解改變表現型突變之基因為何，及可能的機制以導致此種性狀之表達。因此，建立 T-DNA 插入突變點之 FST 資料庫，可加速水稻功能性基因體的研究。本研究希望藉由一個新開發出的 PCR 方法: Hooker adaptor PCR，來快速獲得FST 的資訊。本研究繁殖的 1301 個品系中，總共有 319 個品系有明顯的外觀變異。植物 DNA 利用 CTAB 法萃取，再利用特定的限制酵素切割後，藉由 PCR 方法進行 T-DNA 插入點之 FST 解序。結果得到總共 885條帶，其中以 Inverse PCR (IPCR) 獲得 139 條條帶，AL-PCR獲得 382條條帶，HA-PCR獲得 364 條條帶。 IPCR 解序以 M48821-4、M66317 兩株突變株為例，比對 TRIM 結果， M48821-4之T-DNA 插入水稻第四條染色體， M66317 T-DNA 插入第九條染色體。AL-PCR 以 M27669-8 突變株之 FST 為例，成功解序出 RB 及 LB 之序列，其插入位點幾乎相同且非常相近，皆位於水稻第八條染色體。本研究利用HA-PCR成功解序M60023、M60035 ( 2 x copy ) 兩株突變株之 FST，比對 TRIM 結果 M60023 插入水稻第八條染色體，M60035獲得兩條不同 T-DNA 及 FST，插入位點分別為第六及第九條染色體。於461 株水稻台農67 號 T-DNA 插入染色體之分佈研究結果顯示，其T-DNA 主要分佈在第1、2、3 及第6 條染色體，第9 與第12 條染色體的分佈則為最少的。以IPCR、AL-PCR 及HA-PCR 解序效能比較的結果顯示，IPCR 成功率為17%，得到一個品系條帶時間為3 天。AL-PCR 成功率為21%，得到一個品系條帶時間為3 天。HA-PCR 成功率為56%，得到一個品系條帶時間為1 天。比較後發現 HA-PCR 不但操作簡單，成本的消耗及時間的花費都比其他兩者來的少，HA-PCR 對目前現階段的解序技術來說是非常重要且新穎的，我們認為此為水稻T-DNA 突變品系兩側序列解序之最佳方法。
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