河魨毒生產菌產毒能力與基因圖譜資料之探討

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Title:	河魨毒生產菌產毒能力與基因圖譜資料之探討
Authors:	林春蘭
Contributors:	Department of Health and Nutrition Biotechnology
Keywords:	河魨毒;河魨毒生產菌;16S rDNA
Date:	2010
Issue Date:	2010-09-09 06:28:58 (UTC+0)
Publisher:	Asia University
Abstract:	河魨毒 (tetrodotoxin, TTX) 為海洋生物毒之ㄧ，係一種低分子量 (320 Da) 的非蛋白質之神經性劇毒，具有10餘種衍生物。目前關於含有河魨毒的生物體中河魨毒的來源，大致上有兩種說法，一種是由生物本身體內生合成的內因說，另一種是經由攝食寄生或共生細菌而蓄積在體內的外因說。自1986年由學者Noguchi等人從Xanthid crab的腸道分離出具有河魨毒生產菌後，陸續有多位學者由當地河魨腸道中分離出可生產河魨毒之弧菌Vibrio alginolyticus；由數種海洋標準菌株中，亦檢測出多種微生物V. parahaemolyticus, V. anguillarum, V. cholerae及V. costicols均具有河魨毒生產能力。綜合上述結果，河魨TTX及其衍生物之來源，推論係生息在其腸內之微生物生產所致。為了解在台灣海域之河魨所含有細菌種類，分別於宜蘭大溪漁港和台中港採集黑鯖、滑背、毒鯖河魨之腸壁，使用ORI培養基檢測好氣性生菌數，在ORI培養基的生菌數分別為1.07 × 105 CFU/g、8.01 × 104 CFU/g、9.54 × 107 CFU/g。總共分別分離出286、316、202株，初步依菌落外觀型態分類，使用ORI broth大量培養，經震盪培養3天後，以離心收集菌體。將菌體以超音波破碎機破碎經純化後，以HPLC鑑定河魨毒，初步篩得6株TTX生產菌，進而探討培養條件對河魨毒生產菌產產毒能力之影響，以ORI broth為基礎培養基，分別改變pH值、NaCl濃度和溫度，以試驗菌株在3項條件下之河魨毒生產能力，結果顯示，菌株LiWC263、LLWF001、LLWF013、LLWF049、LLYF008之河魨毒生產性分別在pH 8, 3% NaCl, 25℃有較佳之河魨毒生產量。菌株LiWF271則是在pH7, 3% NaCl, 25℃有較佳之河魨毒生產量。此外，利用16S rDNA基因定序法，進行河魨毒生產菌基因探討與分析，鑑別不同菌株在系統分類所在的位置，分析菌株與菌株之間基因的差異性。結果顯示分離出6株河魨毒生產菌經16S rDNA定序，利用GCG資料庫系統分析共找到相似性之微生物2屬6株 (Shewanell chilikensis, Shewanella waksmanii, Vibrio ichthyoenteri, Vibrio alginolyticus, Vibrio crassostreae, Vibrio splendidus, Vibrio gigantis和Vibrio chagasii.) 。以UPGMA所建構的遺傳相關樹狀圖，顯示菌株與菌株間的差異很明顯，有效的區分菌種中菌株之差異性。
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